Methods for detecting G-protein coupled receptor (GPCR) activity; methods
for assaying GPCR activity; and methods for screening for GPCR ligands,
G-protein-coupled receptor kinase (GRK) activity, and compounds that
interact with components of the GPCR regulatory process are described.
Included are methods for expanding ICAST technologies for assaying GPCR
activity with applications for ligand fishing, and agonist or antagonist
screening. These methods include: engineering seronine/threonine
phosphorylation sites into known or orphan GPCR open reading frames in
order to increase the affinity of arrestin for the activated form of the
GPCR or to increase the reside time of arrestin on the activated GPCR;
engineering mutant arrestin proteins that bind to activated GPCRs in the
absence of G-protein coupled receptor kinases which may be limiting; and
engineering mutant super arrestin proteins that have an increased affinity
for activated GPCRs with or without phosphorylation. These methods are
intended to increase the robustness of the GPCR/ICAST technology in
situations in which G-protein coupled receptor kinases are absent or
limiting, or in which the GPCR is not efficiently down-regulated or is
rapidly resensitized (thus having a labile interaction with arrestin).
Included are also more specific methods for using ICAST complementary
enzyme fragments to monitor GPCR homo- and hetero-dimerization with
applications for drug lead discovery and ligand and function discovery for
orphan GPCRs.
I metodi per la rilevazione della G-proteina coppia l'attività del ricevitore (GPCR); metodi per analizzare attività di GPCR; ed i metodi per selezionare per i ligands di GPCR, l'attività G-proteina-accoppiata della chinasi del ricevitore (GRK) ed i residui che si interagiscono con i componenti del processo regolatore di GPCR sono descritti. Inclusi sono i metodi per l'espansione delle tecnologie di ICAST per analizzare l'attività di GPCR con le domande di pesca del ligand e la selezione dell'antagonista o dell'agonista. Questi metodi includono: i luoghi di fosforilazione di ingegneria seronine/threonine in GPCR conosciuto o orphan aprono le strutture della lettura per aumentare l'affinità del arrestin per la forma attivata del GPCR o aumentare il periodo di rised del arrestin sul GPCR attivato; le proteine di arrestin del mutante di ingegneria che si legano a GPCRs attivato in assenza di G-proteina coppia le chinasi del ricevitore che possono limitare; e proteine eccellenti di arrestin del mutante di ingegneria che abbia un'affinità aumentata per GPCRs attivato con o senza fosforilazione. Questi metodi sono intesi per aumentare la robustezza della tecnologia di GPCR/ICAST nelle situazioni in cui la G-proteina ha accoppiato le chinasi del ricevitore è assente o nel limitare, o in quale il GPCR efficientemente giù-non è regolato o è velocemente resensitized (così avendo un'interazione labile con il arrestin). Inclusi sono inoltre i metodi più specifici per usando i frammenti complementari degli enzimi di ICAST per controllare il homo- e la hetero-dimerizzazione di GPCR con le domande di scoperta del cavo della droga e scoperta di funzione e del ligand per il orphan GPCRs.
