The present invention describes methods of producing milligram quantities
of three forms of purified Stat1 protein from recombinant DNA constructs.
In addition, the Stat proteins may be isolated in their phosphorylated or
nonphosphorylated forms (Tyr 701). The proteins can be produced in
baculovirus infected insect cells, or E. coli. A compact domain in the
amino terminus of Stat1.alpha. was isolated and found to enhance DNA
binding due to its ability to interact with a neighboring Stat protein. A
relatively protease-resistant recombinant truncated form of the Stat
protein was isolated in 40-50 mg quantities. Purification of the Stat
proteins were performed after modifying specific cysteine residues of the
Stat proteins to prevent aggregation. Activated EGF-receptor partially
purified from membranes by immunoprecipitation was shown to be capable of
in vitro catalysis of the phosphorylation of the tyrosine residue of Stat
1 known to be phosphorylated in vivo. Techniques are enclosed to separate
the phosphorylated from the nonphosphorylated Stat proteins. The
techniques disclosed are general for Stat proteins and may be used to
isolate large quantities of purified Stat 2, 3, 4, 5A, 5B and 6. Methods
for using purified Stat proteins, truncated Stat proteins, or Stat
N-terminal fragments for drug discovery are also disclosed.
Die anwesende Erfindung beschreibt Methoden des Produzierens von von Milligrammquantitäten von drei Formen gereinigtem Protein Stat1 aus recombinant DNA Konstruieren. Zusätzlich können die Status Proteine in ihrem phosphorylierten lokalisiert werden oder nonphosphorylated Formen (Tyr 701). Die Proteine können in baculovirus angesteckten Insektzellen produziert werden oder E. Coli. Ein kompaktes Gebiet im Aminoterminus von Stat1.alpha. wurde lokalisiert und gefunden, um DNA das Binden wegen seiner Fähigkeit zu erhöhen, auf ein benachbartes Status Protein einzuwirken. Eine verhältnismäßig Protease-beständige recombinant beschnittene Form des Status Proteins wurde in 40-50 Magnesium Quantitäten lokalisiert. Reinigung der Status Proteine wurden durchgeführt, nachdem man spezifische Cysteineüberreste der Status Proteine geändert hatte, um Anhäufung zu verhindern. Der aktivierte EGF-Empfänger, der teilweise von den Membranen durch Immunopräzipitation gereinigt wurde, wurde gezeigt, um zur in-vitrokatalyse der Phosphorylierung des Tyrosinüberrests von Status 1 fähig zu sein, der bekannt ist, um phosphoryliertes in vivo zu sein. Techniken werden umgeben, um das phosphorylierte von zu trennen nonphosphorylated Status Proteine. Die Techniken, die freigegeben werden, sind für Status Proteine allgemein und können verwendet werden, große Quantitäten gereinigten Status 2, 3, 4, des 5A, des 5B und 6 zu lokalisieren. Methoden für das Verwenden der gereinigten Status Proteine, der beschnittenen Status Proteine oder des Status N-Anschlusses der Fragmente für Drogeentdeckung werden auch freigegeben.
