The present invention relates to a vector for expression of a heterologous
protein by a Gram negative bacteria, wherein the vector includes a nucleic
acid such as DNA encoding the following: an origin of replication region;
optionally and preferably a selection marker; a promoter; an initiation
region such as translation initiation region and/or a ribosome binding
site, at least one restriction site for insertion of heterologous nucleic
acid, e.g. DNA, encoding the heterologous protein, and a transcription
terminator. The inventive vector may contain DNA encoding the heterologous
protein, e.g., pro-insulin such as pro-insulin with a His tag.
Additionally, the invention provides a method for extracting a recombinant
protein from within a recombinant Gram negative bacteria having a cell
membrane, without lysing the bacteria, as well as a method for purifying
an isolated recombinant human insulin, wherein the isolated recombinant
human pro-insulin is subjected to sulfitolysis, Ni-chelation
chromatography, renaturation, limited proteolysis and chromatography
separation to provide purified, isolated, recombinant human insulin.
A invenção atual relaciona-se a um vetor para a expressão de uma proteína heterologous pelas bactérias negativas de um grama, wherein o vetor inclui um ácido nucleic tal como o DNA que codifica o seguinte: uma origem da região do replication; opcionalmente e preferivelmente um marcador de seleção; um promoter; uma região da iniciação tal como a região da iniciação da tradução e/ou um local obrigatório do ribosome, ao menos um local da limitação para a inserção do ácido nucleic heterologous, por exemplo DNA, encoding a proteína heterologous, e um terminal da transcrição. O vetor inventive pode conter o DNA que codifica a proteína heterologous, por exemplo, pro-pro-insulin tal como o pro-pro-insulin com seu Tag. Adicionalmente, a invenção fornece um método extraindo uma proteína recombinant dentro das bactérias negativas de um grama recombinant que têm uma membrana da pilha, sem lysing as bactérias, as.well.as um método para purifying um insulin humano recombinant isolado, wherein o pro-pro-insulin humano recombinant isolado é sujeitado ao sulfitolysis, ao chromatography do Ni-ni-chelation, ao renaturation, a proteolysis limitado e a separação do chromatography para fornecer purified, insulin humano isolado, recombinant.
