A method is presented for the preparation and use of fluorogenic peptide
substrates that allows for the configuration of general substrate
libraries to rapidly identify the primary and extended specificity of
enzymes, such as proteases. The substrates contain a fluorogenic-leaving
group, such as 7-amino-4-carbamoylmethyl-coumarin (ACC). Substrates
incorporating the ACC leaving group show comparable kinetic profiles as
those with the traditionally used 7-amino-4-methyl-coumarin (AMC) leaving
group. The bifunctional nature of ACC allows for the efficient production
of single substrates and substrate libraries using solid-phase synthesis
techniques. The approximately 3-fold increased quantum yield of ACC over
AMC permits reduction in enzyme and substrate concentrations. As a
consequence, a greater number of substrates can be tolerated in a single
assay, thus enabling an increase in the diversity space of the library.
Soluble positional protease substrate libraries of 137,180 and 6,859
members, possessing amino acid diversity at the P4-P3-P2-P1 and P4-P3-P2
positions, respectively, were constructed. Employing this screening method
the substrate specificities of a diverse array of proteases were profiled,
including the serine proteases thrombin, plasmin, factor Xa, uPA, tPA,
granzyme B, trypsin, chymotrypsin, human neutrophil elastase, and the
cysteine proteases papain and cruzain. The resulting profiles create a
pharmacophoric portrayal of the proteases allowing for the design of
selective substrates and potent inhibitors.
Un método se presenta para la preparación y el uso de los substratos fluorogenic del peptide que permite la configuración de las bibliotecas generales del substrato para identificar rápidamente la especificidad primaria y extendida de enzimas, tales como proteases. Los substratos contienen un grupo fluorogenic-que deja, tal como 7-amino-4-carbamoylmethyl-7-amino-4-carbamoylmethyl-coumarin (ACUMULADOR). Los substratos que incorporan el ACUMULADOR que sale del grupo demuestran perfiles cinéticos comparables como ésos con los 7-amino-4-meti'lico-7-amino-4-methyl-coumarin tradicionalmente usados (AMC) que salen del grupo. La naturaleza del bifunctional del ACUMULADOR permite la producción eficiente de solos substratos y bibliotecas del substrato usando las técnicas solid-phase de la síntesis. La producción de quántum aproximadamente tres veces creciente del ACUMULADOR sobre AMC permite la reducción en concentraciones de la enzima y del substrato. Por consiguiente, un mayor número de substratos se puede tolerar en un solo análisis, así permitiendo un aumento en el espacio de la diversidad de la biblioteca. Las bibliotecas posicionales solubles del substrato del protease de 137.180 y 6.859 miembros, diversidad del aminoácido que poseía en el P4-P3-P2-P1 y posiciones P4-P3-P2, respectivamente, fueron construidas. Empleando este método de investigación las especificidades del substrato de un arsenal diverso de proteases fueron perfiladas, incluyendo los proteases trombina, plasmin, factor XA, uPA, tPA, granzyme B, trypsin, chymotrypsin, elastase humano del neutrophil, y la papaína y el cruzain del serine de los proteases del cysteine. Los perfiles que resultan crean una representación pharmacophoric de los proteases teniendo en cuenta el diseño de substratos selectivos y de inhibidores potentes.
