Imaging hardware, software, calibrants, and methods are provided to
visualize and quantitate the amount of Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET) occurring between donor and acceptor molecules in
epifluorescence microscopy. The MicroFRET system compensates for overlap
among donor, acceptor, and FRET spectra using well characterized
fluorescent beads as standards in conjunction with radiometrically
calibrated image processing techniques. The MicroFRET system also provides
precisely machined epifluorescence cubes to maintain proper image
registration as the sample is illuminated at the donor and acceptor
excitation wavelengths. Algorithms are described that pseudocolor the
image to display pixels exhibiting radiometrically-corrected fluorescence
emission from the donor (blue), the acceptor (green) and FRET (red). The
method is demonstrated on samples exhibiting FRET between genetically
engineered derivatives of the Green Fluorescent Protein (GFP) bound to the
surface of Ni chelating beads by histidine-tags.
El hardware, el software, los calibrants, y los métodos de la proyección de imagen se proporcionan para visualizar y para cuantificar la cantidad de transferencia de energía de la resonancia de la fluorescencia (TRASTE) que ocurre entre el donante y las moléculas del aceptador en microscopia del epifluorescence. El sistema de MicroFRET compensa para el traslapo entre donante, aceptador, y espectros del TRASTE usando granos fluorescentes bien caracterizados como estándares conjuntamente con técnicas de proceso radiometrically calibradas de imagen. El sistema de MicroFRET también proporciona los cubos exacto trabajados a máquina del epifluorescence para mantener el registro apropiado de la imagen mientras que la muestra está iluminada en las longitudes de onda de la excitación del donante y del aceptador. Se describen los algoritmos que pseudocolor la imagen para exhibir los pixeles que exhiben la emisión radiometrically-corregida de la fluorescencia del donante (azul), del aceptador (verde) y del TRASTE (rojo). El método se demuestra en las muestras que exhiben el TRASTE entre los derivados genético dirigidos de la proteína fluorescente verde (GFP) limita a la superficie de los granos chelating del Ni por las histidine-etiquetas.
