A method of preparing cell samples for viable cell number quantification with a fluorescence digital imaging microscopy system employing digital thresholding technique. The cell sample is stained with a first, fluorescent dye and treated with a second dye that is able to quench the fluorescence of the first dye. The fluorescent dye accumulates in viable cells only and is used to stain the viable cells. The second dye is excluded from viable cells but enters non-viable cells, thereby quenching the background fluorescence in non-viable cells and the medium. Two examples of dye combinations are described: fluorescein diacetate used as the fluorescent dye with eosin Y as the quenching dye; and calcein-AM used as the fluorescent dye with trypan blue as the quenching dye. By reducing the background fluorescence, the dynamic range and accuracy of viable cell number measurements are enhanced. In low viability cultures treated with fluorescein diacetate, background fluorescence completely masked viable cells, but digital thresholding and eosin treatment dramatically reduced background fluorescence, producing a linear response over 4 logs of viable cell density.

Une méthode de préparer des échantillons de cellules pour la quantification viable de nombre de cellules avec un système numérique de microscopie de formation image de fluorescence utilisant la technique thresholding numérique. L'échantillon de cellules est souillé avec un premier, fluorescent colorant et traité avec un deuxième colorant qui peut éteindre la fluorescence du premier colorant. Le colorant fluorescent s'accumule en cellules viables seulement et est employé pour souiller les cellules viables. Le deuxième colorant est exclu des cellules viables mais écrit les cellules non viables, éteignant de ce fait la fluorescence de fond dans les cellules non viables et le milieu. Deux exemples des combinaisons de colorant sont décrits : diacétate de fluorescéine utilisé comme colorant fluorescent avec de l'éosine Y comme colorant d'extinction ; et calcéine- suis employé comme le colorant fluorescent avec le bleu trypan comme colorant d'extinction. En réduisant la fluorescence de fond, la gamme dynamique et l'exactitude des mesures viables de nombre de cellules sont augmentées. Dans la basse viabilité les cultures ont traité avec du diacétate de fluorescéine, les cellules viables complètement masquées de fluorescence de fond, mais thresholding numérique et la fluorescence nettement réduite de fond de traitement d'éosine, produisant une réponse linéaire plus de 4 notations de densité viable de cellules.